凝胶色谱仪是一种起源于20世纪60年代的色谱分离技术，其主要根据不同化合物分子流体力学体积大小不同进行分离，流体力学体积大的组分率先流出柱外，反之随后，分离原理类似于分子筛，又称之为分子排阻色谱法(SEC)[1]。根据待测组分极性大小不同，凝胶色谱可以分为凝胶过滤色谱(GFC)和凝胶渗透色谱(GPC),前者一般采用水溶性、缓冲溶液作为流动相，后者的流动相则选用有机溶剂。凝胶色谱的分离效果主要与待测物质的分子流体力学体积大小、色谱柱填料的孔径和粒度大小、柱容积和长度、检测器种类不同等因素有关，从而区别于常见的依赖吸附、分配、离子交换作用力等色谱技术，成为广泛应用的第四类液体色谱技术[1]。
近年来，随着凝胶色谱理论、填料制备工艺、仪器设计水平和各类检测器搭配使用四方面的联合发展，凝胶色谱具备高分辨率、高重现率、实验条件温和、溶质回收率高、分析速度快等优点，成为比其他色谱技术更独特的一种化学分离技术。凝胶色谱在测定聚合物相对分子质量和排布、分析高分子杂质含量、药物分离预处理和纯化等方面表现出色，广泛应用于医药、石油、材料、食品等领域并展现出广阔的市场前景和价值潜力。
1 凝胶柱色谱填料的基本类型
柱色谱填料是凝胶色谱技术的核心。目前已报道的填料有非凝胶类(分子筛、微孔聚合物、玻璃珠微孔硅胶、氧化锆微球、无孔硅胶)和凝胶类(聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、聚苯乙烯、琼脂糖),其中基于凝胶的柱填料使用最为广泛[2],表1罗列了不同凝胶类柱填料的合成方法和应用。
表1常用填料的制备方法、代表性产品及其应用
| 类型 | 常用合成方法 | 代表性产品 | 应用范围 |
| 交联葡聚糖 | 反相乳液聚合法和乳化交联法 | G-25、50、75、100、200 | 核酸分离纯化[3] |
| 聚丙烯酰胺 | 均相法、非均相法 | Bio-Gel P-2、4,ZSP-10 | 蛋白质和低聚糖等纯[4-6] |
| 琼脂糖 | 悬浮搅拌法、喷射法 | 琼脂糖凝胶4B,CL-4B、6B | DNA和蛋白质等分离[7] |
| 聚苯乙烯 | 种子聚合法 | Styrogel | 抗肿瘤、手性药物等分离[8] |
凝胶色谱性质、特点及发展概况
最早，凝胶色谱填料是在1987年被首次发现，法国罗纳普朗克化学股份有限公司公开了一种干料经过水合之后可用于亲和色谱的技术，并申请了一项专利(CN87102772A)。同年德国默克专利股份有限公司，也紧跟其步伐，将甲基丙烯酰基与硅胶相接，用于分离外消旋混合物(CN87104030A)。随后凝胶色谱填料和介质的制备研究便得到了迅猛发展。欧美国家合成了制备交联多糖色谱填料、琼脂糖珠粒等多种早期凝胶色谱填料物质，为凝胶色谱的技术革新开创了一片新天地。在我国，1998年武汉大学最早开展了凝胶色谱的研究，公开了一种凝胶渗透色谱柱填料(多孔再生纤维素圆柱体填料)的合成方法，该填料具有简单、快速、经济的优点(CN1243761A)。为我国凝胶色谱产业发展奠定了重要的基础。近些年，伴随着凝胶色谱理论和高分子合成工业的蓬勃发展，许多性能优良的凝胶色谱在天然药物化学领域中表现出色，并以自身独特的优势贯穿到该领域中的药物制剂、提取分离、鉴定等多个过程中，我国国内经典的凝胶色谱填料产品参数见表2。
表2国内市场常见的部分凝胶色谱填料参数
| 型号 | 分离范围/Da | 颗粒大小/μm | pH值稳定性 | 纯化产物 |
| G-25 | 100～5 000 | 22～44 | 3～12 | 多糖A1、A2[9] |
| G-75 | 1 000～50 000 | 22～44 | 3～12 | PPS80-I和PPS80-II[10] |
| G-100 | 1 000～100 000 | 22～44 | 3～12 | SCSP[11] |
| Bio-Gel P | 100～100 000 | 22～44 | 2～10 | 木低聚糖[12] |
| 琼脂糖凝胶4B | 60 000～20×106 | 45～165 | 4～9 | 大分子蛋白质[13]DNA |
3 凝胶色谱在天然药物化学中的应用
天然药物化学是一门运用现代科学理论、方法和技术研究天然药物(植物、动物、矿物、海洋生物、微生物)中化学成分(结构特点、理化性质、提取、分离、鉴定方法、生物活性和构效关系)的化学和药学交叉学科[14-15]。凝胶色谱是一种具有独特分离纯化功能的工具，能利用其分子筛原理按照分子大小提供未知化合物的详细信息，在天然药物化学成分提取、纯化和鉴定过程中发挥着重要作用[16]。特别是高效凝胶色谱的出现，有力拓展了凝胶色谱在小分子化合物分离领域中的应用。
3.1 凝胶色谱在天然药物化学提取、分离方面的应用
天然药物化学成分一般比较复杂，要想对其展开研究和应用，首先需要提取、分离和纯化。传统的分离纯化方法有浸渍法、渗漉法、沉淀法、蒸馏法和回流提取法等，这些方法需要经过过滤、洗涤等复杂操作或使用大量不同极性的有机溶剂。而凝胶色谱在分离纯化过程中不需要有机溶剂，操作简单，绿色环保，是目前较为常用的手段之一[16]。
中药多糖在自然界中广泛存在，具有延缓衰老、抗肿瘤、降血脂、降血糖、免疫调节等多种生理活性，从中药材中提取往往伴随大量杂质。黄春花[17]建立凝胶渗透色谱(GPC)法对枸杞内多糖含量进行测定，利用PL-GPC50型凝胶色谱仪和TSKgel G5000 PWXL型色谱柱在KH2PO4作为流动相、浸提温度为100 ℃、时间4 h等参数条件下，发现宁夏秋果的多糖含量远高于青海夏果。操作过程无须使用有机溶剂，环保低耗且数据与相关文献报道基本一致，凝胶色谱检测结果展现出良好的检测性能。一些生物活性物质对温度和分离条件要求较高，为避免在分离纯化过程中引入热源和异体蛋白等杂质，凝胶色谱法作为一种温和的纯化手段能取得良好的分离效果。毛田米[18]通过优化凝胶色谱实验条件分离纯化大米免疫活性肽，实验采用型号Sephadex G-10葡萄糖凝胶，在检测波长220 nm, 上样体积4 mL和洗脱速率15 mL/h条件下，分离得到的组分F4在小鼠巨噬细胞增殖方面表现出极显著的促进作用。李艳伟等[19]采用Sephadex G-15凝胶过滤色谱对猪血蛋白胰蛋白酶酶解物进行分离纯化，结果表明相对分子质量较低的组分D具有较强的免疫活性，通过优化工艺参数更有利于产业化。
3.2 凝胶色谱在药物相对分子质量和排布的测定方面的应用
相对分子质量是多糖物质的重要特征性参数，大多数多糖结构复杂且形式多样，因此对于一些中药成分中的多糖相对分子质量测定方法鲜有报道。顾健等[20]利用TSK G3000 PWXL凝胶色谱柱和Shodex RI-101型示差检测器对以黄精多糖为主要有效成分的滇黄精中多糖相对分子质量进行测定。结果表明：组分PK-F1的重均相对分子质量(Mw)测定为145 850,未见相关文献报道，为进一步探讨其结构提供了思路。该方法快速、有效、重复性好，为滇黄精相对分子质量测定的有力手段。王泽云等[21]利用水凝胶色谱柱UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mmid×2),建立了高效凝胶过滤色谱法测定皂角米中多糖相对分子质量和组分含量。检验证，该法具有高重复率、高回收率和高重现率等优势，可用于皂角米多糖组分检测，促进其应用技术发展。葛鸽等[22]采用TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm, 5 μm)凝胶色谱柱，在检测器波长220 nm条件下对29批次的特殊医学配方婴儿乳粉中肽段分布进行分析。我国特医乳粉肽段相对分子质量分布广，选用合适的提取和检测方法至关重要，该方案前处理简单、稳定性高、数据准确可靠，能全面展现肽段全貌(测定范围到10 000 u左右),可满足基本检测需求，为特医乳粉质量控制提供参考，同时为质量监督部门提供相关产品评价依据。
3.3 凝胶色谱在药物中高分子杂质测定方面的应用
高分子杂质是指药品或中药材中相对分子质量大的(超过10 000 Da)一类化合物。据文献报道其来源一般分为内源性(发酵工艺引入多糖、鞣质或这类大分子与抗生素结合)和外源性(中药材中动植物异性蛋白、储存和使用过程中抗生素自身聚合形成等)[16]。高分子杂质的存在会引发呼吸和心血管系统、速发型过敏等一系列药物不良反应，存在严重的用药隐患[23-25]。因此如何快速、准确地控制药物中高分子杂质的含量，保证用药安全，成为越来越多的学者关注的焦点。
中药注射液是指将饮片经提取纯化工艺后制成的可供体内注射用的剂型，具有高效、便捷等多种优点而得到临床方面的广泛应用。与之相对应的是有关药品不良反应的案例逐年攀升，目前普遍认为注射液中的高分子杂质(原药材中动植物异性蛋白等)是引发的原因之一[23-25]。李泳雪等[26]采用TSK G2000 SWxl 凝胶色谱柱，在检测波214 nm条件下，应用凝胶色谱法对3种常用中药注射液(黄芪注射液、清开灵注射液、参芪扶正注射液)中的动植物异性蛋白进行测定。经验证，该方法安全可靠，便捷高效，弥补了中药注射液中检测此类高分子杂质方法的长期缺位。张军霞等[27]和杨欣茹等[28]同样利用这款型号的凝胶色谱柱对相应的高分子杂质进行准确检测，前者建立了一种对国内3个厂家6批双黄连注射液中的高分子杂质起到良好检测效果的色谱方法，为双黄连注射液的安全性评价提供新思路。后者则建立了检测生长抑素中高分子杂质的方法(自身对照法),该方法专属性强、灵敏度高，为多肽药物的质量控制提供了参考。中国药典从2000年版开始收录关于检测头孢菌素类中聚合物含量的方法，李伟[29]汇总并对比分析了中国药典2000—2020版中利用凝胶色谱和高效凝胶色谱检测头孢菌素11个品种中高分子杂质的工艺方法，结果表明凝胶色谱分离效果好、准确性高，能对头孢菌素众多品种的质量控制提供依据。
3.4 凝胶色谱与其他技术的联用
近年来，随着现代仪器和检验技术的蓬勃发展，凝胶色谱法和其他检验技术的联用受到重视。这种“新合作”因具有高分辨率、高灵敏度和高自动化等显著优势而引起各领域的青睐，同时也成为未来检测技术发展的风向标。
杨坤等[30]建立凝胶色谱—高效液相色谱联用法(GPC Cleanup 800凝胶色谱仪-E2695型高效液相色谱仪)同时测定了山茶油中9种抗氧化剂(PG、TBHQ、THPB、BHA、NDGA、Ionox-100、OG、BHT、DG)。方法验证结果表明，该方法快捷、可靠，符合分析检测标准。相比常用的检测方法(气相色谱法受限于化合物极性和沸点、液相色谱—质谱法设备昂贵且油样基质效应较大，定量困难)具有明显的优势。娄小涵等[31]利用透析—凝胶渗透色谱联用方法，以河蚬为实验对象，建立了一种除脂率高，用于非目标筛查的生物样品前处理方案。该方案改进了样品前处理条件，降低生物样品净化流程中的操作难度，同时提高了宽泛程污染物的提取效果。祝亦哲等[32]建立超声辅助萃取—凝胶渗透色谱净化联合超高效液相色谱—高分辨质谱(UPLC-HRMS)分析系统，实现了对常见食用鱼肉中12种HOPs(有机污染物)的快速定量和准确检测，为该物质的质量控制提供有力依据的同时为相关市监部门提供技术支撑。
4 前景展望
综上所述，凝胶色谱已被应用到天然药物化学领域中多个重要环节。作为一种高效的液相色谱技术，凝胶色谱在与其他技术联用时优势突出，尤其是处理复杂药品时，既能快速实现样品分离纯化，又能准确测定微量成分含量。国内已有凝胶色谱在核酸检测[33]、微量物证[34]检测等领域的相关报道。随着理论系统不断完善和仪器技术(装柱技术、新型色谱填料：手性色谱填料、混合模式色谱填料等)不断革新，同时外部严峻形势(复杂的药物类型以及产业化多方面的需求)的倒逼，凝胶色谱必定会在天然药物化学领域应用更广泛、影响更深入。
